L’intrigue de La nuit au musée 2 se passe cette fois-ci au Smithsonian (Washington). Larry Daley y retrouve Octavius et Jedediad envoyés par erreur dans ce musée. Ils y croiseront le général Custer, Amelia Earhart, le pharaon démoniaque Kahmunrah, Ivan le terrible, Napoleon Bonaparte et Teddy Roosevelt.